4.  CART細胞結構

CAR結構包含

1. 抗體的單鏈可(ke)變區(qu)（scFv）
2. 非信號胞外區(qu)
3. 與scFv鏈(lian)接的鉸鏈(lian)區
4. 跨膜區
5. T細胞受體胞內CD3ζ區
6. 共刺激因子結(jie)構域

四代CAR的發(fa)展

• 第一代CART誘(you)導(dao)T細胞激活僅通過cd3ζ信號域(yu)激活
• 第(di)二(er)代CART中增加了共刺激(ji)結構域
• 第三(san)代(dai)CART增加(jia)兩個共(gong)刺激結構域
• 第四代CART增加酶、細胞(bao)因子和(he)共刺激(ji)配體

5.  T細胞擴增

在CART細(xi)(xi)胞(bao)擴增(zeng)過程中(zhong)，細(xi)(xi)胞(bao)數量不斷增(zeng)加，培養基體積(ji)增(zeng)大(da)，必須通過更多或(huo)更大(da)的(de)組織培養瓶，這(zhe)極大(da)地復(fu)雜化了制造(zao)過程，并且(qie)它無法實現大(da)規模的(de)生產。

靜態培養袋，允許較(jiao)少(shao)的手動開放處理，管道連接可以使其在(zai)無菌條(tiao)件下進行。

另一(yi)種方法 使(shi)用生(sheng)物反應器，如(ru)Xuri細胞擴增系(xi)統和Wave生(sheng)物反應器系(xi)統，利用灌注機制(zhi)添加營養物質(zhi)(zhi)以及(ji)去除(chu)生(sheng)長抑制(zhi)物質(zhi)(zhi)，從而簡化了制(zhi)造過程。

6.  細胞(bao)因子(zi)刺激

細(xi)胞因(yin)子(zi)在工藝中使用，作為刺激信號(hao)，對于CART細(xi)胞質量，表型等產生重要影響。主要是γ鏈細(xi)胞因(yin)子(zi)：IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21。常用IL-2 或者IL-7,同(tong)時使用/或者不適(shi)用IL-15.

諾華Yescarta使用(yong)IL-2，但是IL-2會導致分(fen)化和(he)耗竭的T細(xi)胞表(biao)型(xing)。IL-7/IL-15可以增(zeng)強T細(xi)胞活(huo)化和(he)增(zeng)殖(zhi)，二者聯合使用(yong)可以增(zeng)加(jia)未分(fen)化CART（TN，TSCM）的存活(huo)和(he)維持(chi)。單獨添(tian)加(jia)IL-15也會增(zeng)加(jia)耗竭表(biao)型(xing)，及抗(kang)凋亡活(huo)性。

和IL-2和IL-15比較，IL-21可以增(zeng)加(jia)CD62L表達，增(zeng)加(jia)抗腫瘤活性。

7.  抑制(zhi)特定的信號通(tong)路(lu)

主要(yao)靶向GSK3β, mTOR, AKT, 和PI3K：

• GSK3β阻斷T細胞分化，產生更多的TSCM

• mTOR inhibitor rapamycin增(zeng)加CD62L表達

• 體外AKT抑制劑也(ye)表現出(chu)增加T細(xi)胞抗腫瘤(liu)活性

• PI3K抑制劑idelalisib，降低調節性T細胞，逆轉腫瘤免疫耐受，增加低分化CART細胞數量

8. 冷凍保存

冷凍保(bao)存CART細(xi)胞(bao)長(chang)達90天，不影響細(xi)胞(bao)的活力(li)。使用(yong)前37℃過(guo)夜，可以恢(hui)復CART細(xi)胞(bao)活力(li)。