qPCR 實驗在分析 C_T 時常常遇到這幾類問題，比如：

• 復(fu)孔間重復(fu)性差，是(shi)否都和操(cao)作(zuo)有(you)關？

• 無模板陰性對照出現 C_T 值時，目的基因的 C_T 值是否還能用？

• C_T 值很大該怎么辦？

今天就給大家分享下，在 qPCR 實驗中遇到關于 C_T 值的常見問題時該如何解決。

復(fu)孔間重復(fu)性差一般(ban)會有(you)以(yi)下兩種情(qing)況：

（1）C_T 值很大，如 C_T ≥ 30，重復性差屬于正常現象。該現象符合泊松分布，即在有效模板量很少的情況下，模板與引物的碰撞存在隨機性，直接導致復孔間的 C_T 值差異較大。

解決方法：如果融解曲線沒有雜峰，無模板陰性對照同目的基因的 △C_T 值為 3 or 5 以上，那 C_T 值為準確的，可多設置幾個復孔，選擇重復性好的 C_T 值參與計算。

（2）C_T ＜30，重復性較差。這種情況一般同操作有關。

解決辦法：從以下幾個方面進行問題的排查：① 加樣準確度；② 移液器吸取液體的準確度；③ 定期(qi)校準 qPCR 儀。

① 加樣準確度(du)

• 避免小體積加樣，減少加樣誤差。可以將引物、SYBR Green Mix、ddH₂O 配置成混合體系，并且增加模板的稀釋梯度，大體積加樣。如：原液 cDNA 添加 1 μL，可以更改為原液 cDNA 稀釋 5 倍，添加 5 μL，使用 ddH₂O 補齊體系至 20 μL 即可。

• SYBR Green Mix、配置的(de)混合體系(xi)需要(yao)混合均勻(yun)(yun)。從 -20 ℃ 冰(bing)箱拿(na)出(chu)的(de)試劑(ji)需要(yao)完(wan)全(quan)融化并上(shang)下顛倒徹底混勻(yun)(yun)；配置體系(xi)時，將混在一起的(de) Mix 用移液器吹(chui)打混勻(yun)(yun)。

② 移液(ye)(ye)器吸(xi)取液(ye)(ye)體的(de)準確度

• 移液器量程定期校準，校準周期為 1 年。

• 購買與移(yi)液(ye)器配套的(de)槍(qiang)(qiang)頭，若(ruo)槍(qiang)(qiang)頭與移(yi)液(ye)器不匹配，在吸取(qu)液(ye)體時易出現漏氣(qi)的(de)現象，導致吸取(qu)量程不準確。

• 在(zai)吸取(qu)相同量(liang)程的液(ye)體體積時，注(zhu)意觀察每次(ci)吸取(qu)液(ye)體在(zai)槍頭內的液(ye)面高度是(shi)否一(yi)致。

③ 定期(qi)校準 qPCR 儀

• 一(yi)般 qPCR 儀(yi)校(xiao)準周期為一(yi)年。

  
  

未完待續(xu)...

轉自：諾唯贊