根據治療細胞的類型，我們大致可(ke)以分(fen)為免疫(yi)細胞和(he)干(gan)細胞，如下圖所(suo)示(shi)。

CAR-T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)治療是一(yi)種(zhong)以(yi)患(huan)者自身T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)為基(ji)礎的治療，通過(guo)白(bai)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)分(fen)離(li)(li)術(shu)收(shou)集患(huan)者的外(wai)周血單核細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（PBMC細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao))，再分(fen)離(li)(li)出(chu)特定的T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)亞群，如(ru)CD4+、CD8+、CD25+或(huo)CD62L+T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。分(fen)離(li)(li)出(chu)的T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)起(qi)始亞群需要(yao)持(chi)續和充分(fen)的激(ji)活(huo)才能實現(xian)體(ti)外(wai)擴增，這就需要(yao)通過(guo)T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)受體(ti)信(xin)號和CD28、4-1BB或(huo)OX40信(xin)號等共刺(ci)激(ji)信(xin)號產(chan)生主要(yao)的特異性信(xin)號，從而激(ji)活(huo)T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。再通過(guo)電(dian)穿孔(kong)、慢(man)病毒或(huo)逆轉錄病毒載(zai)體(ti)，將CAR基(ji)因導入激(ji)活(huo)的T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中進行(xing)基(ji)因修飾，從而得到(dao)可(ke)表達CAR基(ji)因的CAR-T細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)（如(ru)下圖所示(shi)為整(zheng)個CAR-T生產(chan)的流程）。

曾有報道，作為兩家CAR-T原研藥生產廠家，諾華的Kymriah和Kite制藥的Yescarta在早期CAR-T制備的失敗率都比較高，而這些失敗的原因中除了病人因為個體差異而導致失敗外，制備得到的CAR-T細胞質量和數量也是很重要的因素。

3.1 T細(xi)胞刺激后體(ti)積監控的重要性

由Springer（施普林格科學）公司于2017發行，題為Methods in Molecular Biology - Acute Myeloid Leukemia - Methods and Protocols （分子生物學方法 -急性髓細胞白血病-方法和方案）的參考標準方法流程中，刊登了一篇名為Generating and Expanding Autologous Chimeric Antigen Receptor T Cells from Patients with Acute Myeloid Leukemia，的文章（如左下圖），由幾位著名的T細胞高手(Saad S. Kenderian, Carl H. June, 和 Saar Gill)編寫的急性髓細胞白血病自體Car-T細胞的生成和擴增方法。

在3.1的＂從(cong)AML患者擴增T細(xi)胞(bao)＂過程，由刺激日起計的第3天(tian)，每隔(ge)1天(tian)要進(jin)行細(xi)胞(bao)計數(shu)，保持(chi)細(xi)胞(bao)在1x10⁶細胞(bao)/mL。第6天(tian)磁珠(zhu)轉移后，也需要進行細胞(bao)計數。

除了細(xi)(xi)(xi)胞計數外，還要通過庫(ku)爾(er)特計數和(he)粒(li)度(du)分析儀Multisizer來記錄平均細(xi)(xi)(xi)胞體積（MCV），因MCV上升等于T細(xi)(xi)(xi)胞被(bei)激活，而(er)在被(bei)激活后(hou)的第5-7天達(da)到(dao)最大。然后(hou)隨著T細(xi)(xi)(xi)胞開始休息而(er)下降。當MCV變為300 fL（通常在第9-14天范圍）時表明細(xi)(xi)(xi)胞得到(dao)了充分休息，可(ke)以進(jin)行后(hou)續的冷藏或(huo)測試(shi)（如(ru)右下圖）。

通過監測T細胞的體積，比較不同CAR-T細胞及T細胞的平均體積差異，比較培養激活過程中的體積變化，幫助判斷細胞何時到靜息/穩定狀態，另外幫助判斷細胞的激活強度，為研究做出科學判斷或決定下一步操作，如后期的功能檢測或冷凍保存等。

那么為何庫(ku)爾特(te)法的(de)(de)Multisizer可以準確地(di)給出T細胞激活(huo)后體積的(de)(de)變(bian)化值呢？這是因為庫爾特法的原理，以及Multisizer配備了數字脈沖處理器（DPP），庫爾特的原理是通過檢測單個細胞通過小孔時電壓的變化來精確記錄，并且換算得到每個細胞的體積，而配備的數字脈沖處理器，可以使得檢測的分辨率達到nm級別，所以可以對細胞體積的微小變化都能準確的記錄下來。

另外，如果采用傳統的顯微鏡或其他圖(tu)像法儀器觀察細胞體積(ji)的變(bian)(bian)化，不僅(jin)看到的是二(er)維的圖(tu)，并不能(neng)真正(zheng)反(fan)映(ying)(ying)反(fan)映(ying)(ying)細胞整體真實的體積(ji)大小。并且細胞體積(ji)的微笑變(bian)(bian)化，體積(ji)表征相對細胞直(zhi)徑的表征更加(jia)明顯。譬如，10um的細胞，直(zhi)徑變(bian)(bian)大了5%，由于圖(tu)像法的分(fen)辨(bian)率差很難看出(chu)差異，但按體積(ji)計算，體積(ji)的增加(jia)能(neng)達(da)到15.7%，加(jia)上Multisizer的DPP功能(neng)，可以實現(xian)所關注(zhu)粒(li)(li)徑范圍最多400個粒(li)(li)徑分(fen)析通道(dao)（如下圖(tu)所示(shi)），真正(zheng)實現(xian)高分(fen)辨(bian)地檢(jian)測體積(ji)的變(bian)(bian)化。

3.2 CAR-T細胞(bao)的(de)數量和活(huo)率(lv)監控

2019年在SCI Immunotherapy雜志發表了(le)一(yi)篇重(zhong)(zhong)磅(bang)文(wen)章《TREM1/Dap12-based CAR-T cells show potent antitumor activity》中描述，體外培養擴增過程中，除了(le)使用Multisizer來檢測(ce)細(xi)胞體積外，細(xi)胞數量(liang)和(he)活率的(de)檢測(ce)也一(yi)樣重(zhong)(zhong)要。

不同處理得到的CAR-T細胞擴增速率也是不同的，我們可以通過擴增時間的比較來檢查細胞生長狀態的好壞，以此幫助分析得到合適的細胞培養條件和細胞處理方法。

另外，對于進入生(sheng)產化的(de)細胞產品，所有的(de)分析儀器都(dou)需要合規，包括來自FDA 21CFR Part11和(he)GMP生(sheng)產要求，儀器操作(zuo)要有多(duo)級管(guan)理(li)權限，操作(zuo)和(he)報錯都(dou)必(bi)須存(cun)有電(dian)子記錄(lu)，Vi-CELL BLU對已經(jing)考慮到(dao)了這些生(sheng)產質控的(de)要求，所以(yi)分析軟(ruan)件都(dou)能符合這些規定。

CAR-T細(xi)胞(bao)免疫(yi)治療(liao)的過程

CAR-T細胞(bao)免疫療法在(zai)(zai)近(jin)幾年來(lai)被越(yue)來(lai)越(yue)多大眾所了(le)(le)解(jie)，也(ye)有大量的(de)(de)生物制(zhi)藥(yao)(yao)公司加(jia)入到CAR-T細胞(bao)免疫治療的(de)(de)隊(dui)伍，國外目前上(shang)市(shi)(shi)原研(yan)藥(yao)(yao)還是諾華的(de)(de)Kymriah和(he)(he)被吉利(li)德收購德Kite制(zhi)藥(yao)(yao)德Yescarta。而(er)國內(nei)企業(ye)也(ye)在(zai)(zai)加(jia)緊研(yan)發(fa)和(he)(he)上(shang)市(shi)(shi)的(de)(de)步伐，其中復興(xing)凱特和(he)(he)藥(yao)(yao)明巨諾分(fen)別在(zai)(zai)今年的(de)(de)2月(yue)和(he)(he)6月(yue)遞交了(le)(le)上(shang)市(shi)(shi)申請(qing)。如下(xia)是這幾家(jia)公司CAR-T研(yan)發(fa)生產上(shang)市(shi)(shi)的(de)(de)進展表。其中，作為國內(nei)龍頭之(zhi)一(yi)的(de)(de)南京傳奇也(ye)在(zai)(zai)全力地推動產品的(de)(de)商業(ye)化，預計下(xia)半年會在(zai)(zai)美國遞交上(shang)市(shi)(shi)申請(qing)。